Componenta 9 Suport pentru sectorul privat, cercetare, dezvoltare și inovare

Investiția 8 „Dezvoltarea unui program pentru atragerea resurselor umane înalt specializate din străinătate în activități de cercetare, dezvoltare și inovare” (PNRR-III-C9-2023-I8)

„PNRR. Finanțat de Uniunea Europeană – UrmătoareaGenerațieUE”

 

Informatii generale

Titlul proiectului: « Reactivation of hypermethylated genes and correction of pathogenic mutations by genome-editing technologies in personalized medicine approaches in HCC organoids models »
“Reactivarea genelor hipermetilate și corectarea mutațiilor patogene prin tehnologii de editare a genomului pentru a dezvolta medicina personalizată în modelele de organoizi HCC”
CF 150/31.07.2023,

Nr.contract de finanțare: 260281/26.03.2024
Numele beneficiarului: INSTITUTUL CLINIC FUNDENI
Valoare contract fara TVA: 5.999.957 lei
Durata proiectului: 26.03.2024 – 30.06.2026
Director de proiect: ONG CHOON KIAT

Obiective generale

Ȋn proiectul NEXTGenED vom investiga cauzele genetice şi epigenetice implicate în progresul carcinomului hepatocelular (HCC). Vom utiliza cele mai noi tehnologi de editare a genomului pentru a studia mecanismul inițierii și dezvoltării HCC. S-a demonstrat că hipermetilarea promotorului genelor joacă un rol crucial în dezvoltarea cancerului hepatic. Astfel, ne propunem să studiem starea de metilare a promotorilor implicați în silentiere epigenetică. Mai exact, vom studia demetilarea promotorilor hipermetilați implicați în HCC prin utilizarea celor mai noi tehnologii Casilio (sistem CRISPR/Cas9) și de editare primară a genomului pentru a realiza demetilarea promotorului genei și a restabili expresia genei împreună cu proteina corespunzătoare. De asemenea, vom investiga rolul mutațiilor în dezvoltarea cancerului hepatic. Intenționăm să utilizam tehnologii de editare de baze și editare primară pentru a corecta mutațiile și a restabili aminoacizii alelei normale. Ne propunem să facem această investigație genetică utilizând atât culturi de celule primare, cât și culturi de organoizi pentru a realiza un studiu cuprinzător care ne va conduce la o mai bună înțelegere a inițierii și dezvoltării HCC. De asemenea, vom realiza un studiu comparativ între organoizii nontumorali, organoizii tumorali şi organoizii tumorali cu mutația corectată împreună cu screening-ul medicamentelor.

Implementarea proiectului va elucida rolurile defectelor genetice și epigenetice care au apărut în timpul inițierii și dezvoltării HCC şi va dezvolta noi strategii terapeutice.

Obiective specifice

OS 1: Reactivarea genelor hipermetilate patologic care sunt implicate în dezvoltarea cancerelor hepatice în modelele organoide prin editarea genomului cu ajutorul CRISPR/Cas9

OS 2: Corectarea mutațiilor patogene indel (inserție și deleție) prin editare primară

OS 3: Reintroducerea aminoacidului din alele normală în genă mutantă folosind tehnologii de editare primară și de editare a bazelor

OS 4: Studiu comparativ pentru translatarea clinică a organoizilor derivaţi ​​de la pacienți tratați cu medicamente (cu mutații necorectate și corectate) și screeningul medicamentelor pentru a identifica sensibilitatea la agenții terapeutici ai organoizilor

Generarea de organoizi cancerigeni din tesutul primar al pacientului permite testarea unei game de agenți terapeutici cu aplicatii in medicina personalizata.

Toate aceste obiective ne vor permite să obținem o perspectivă mecanistică asupra proceselor de inițiere și evoluție a HCC în organoizi, ceea ce poate duce la un tratament personalizat al pacienților cu HCC.

REZULTATE

ETAPA DE RAPORTARE: ETAPA 1/2024 (01.04.2024 – 30.06.2024)

Rezumat etapa 1/2024: A fost obtinut avizul favorabil pentru implementarea studiului cu nr. 32744/08.07.2024, aviz eliberat de catre Comisia de Etica a Institutului Clinic Fundeni. Includerea în proiectul NEXTGenED a pacientilor se va face cu respectarea normelor etice naționale si internationale în vigoare conform formularului de consimtamant liber exprimat. Procedura de receptionare si prelucrare a probelor (Biobancarea) va include proceduri specifice pentru bancare probe sange, tesut tumoral si non-tumoral. Pentru toate probele receptionate în vederea înregistrarii şi biobancării a fost stabilita fisa de receptionare a probelor biologice (fisa de includere in studiu). In perioada de raportare au fost dezvoltate protocoalele şi procedurile de lucru, astfel au fost intocmite protocoalele de lucru pentru 1) izolarea celulelor din ficat 2) disocierea celulelor din ficat si 3) Însămânțarea celulelor în matrigel pentru obtinerea organoizilor 4) pasarea organoizilor si 5) diferentierea hepatocitelor in vitro. De asemenea, a fost iniţiată  dezvoltarea protocoalelor şi a procedurilor de lucru pentru activitatile din etapa 2: construcţia sgRNA pentru demetilarea promotorului CDKN2A si respectiv producerea si purificarea adenovirusurilor asociate si lentivirusurilor. A fost realizat: 1) Design-ul primerilor 2) Lista de primeri necesară pentru clonarea sgRNA-urilor 3) protocol optimizat pentru producerea si purificarea adonovirusurilor asociate

ETAPA DE RAPORTARE: ETAPA 2/2024 (01.07.2024 – 31.12.2025)

Rezumat etapa 2/2024: Pe parcursul etapei 2 a fost iniţiată activitatea de includere in studiu a pacienţilor, respectiv de izolare celule hepatice, fiind realizată bancarea de probe pentru 19 pacienţi în timp ce banca de celule primare master (P0-P4) a fost realizată pentru 9 donatori in vederea realizării experimentelor propuse. Totodata s-a realizat amplificarea plasmidelor necesare pentru demetilarea promotorului CDKN2A. Pentru acest scop s-au preparat celule DH5α competente si s-au trasnformat cu constuctele necesare pentru demetilare, iar apoi s-a izolat ADN-ul plasmidial. S-a initiat procesul de clonare a sgRNA specifici pentru promotorul CDKN2A. Inainte de a se clona efectiv sgRNA este necesar sa se construiasca 2 vectori: unul fiind reprezentat de vectorul de clonare, iar celalalt vector care va servi drept template pentru generarea celor 8 sgRNA-uri. Astfel pentru constructia celor 2 vectori s-a amplificat vectorul si doua fragmente urmat de asamblarea Gibson. În vederea determinari statusului de metilare a promotorului CDKN2A, s-a izolat ADN-ul genomic din liniile celurare HepG2 si Huh7 cu ajutoului unui kit, urmat de tratarea cu bisulfit pentru conversia citozinei nemetilate in uracil si astfel putandu-se determina statusul metilarii promotorului. De asemenea, s-a izolat ARN-ul totat din linile celulare HepG2, Huh7 si Hep3B in vederea clonarii genelor TP53, CTNNB1, LRP1B, ARID1A, AXIN1, ARID2 si determinarii prezentei de mutatii punctiforme si mutatii de tip indel. In acest context, s-au amplificat si izolat plasmidele necesare pentru corectia mutatiilor punctiforme si de tip indel, iar apoi identitatea plasmidelor izolate s-a verificat prin digestia cu enzime de restrictie cu specificitate de clivare unica in secventa plasmidiala.

 

ETAPA DE RAPORTARE: ETAPA 3/2025 (01.01.2025 – 30.06.2025)

Rezumat etapa 3/2025: În etapa 3 a continuat activitatea de includere a pacienților în studiu, respectiv izolarea celulelor primare hepatice, fiind efectuată stocarea probelor pentru 17 pacienți, în timp ce biobanca de organoizi hepatici derivaţi de la pacienti (PDO) (P0-P4) a fost creată pentru 6 probe de ţesut hepatic non-tumoral și 4 probe de tesut hepatic tumoral în vederea desfășurării experimentelor propuse. Pacienții au fost clasificați în funcție de afecțiunile lor după cum urmează: 9 pacienți cu carcinom hepatocelular (HCC), 2 pacienți cu adenocarcinom metastatic (ADK), 1 pacient cu colangiocarcinom tumoral (CCA) și 5 pacienți aflați în faza de diagnostic patologic. Grupul este reprezentat de 65% bărbați și 35% femei, cu o vârstă medie de 65 de ani. Totodată, au fost identificate două tipuri distincte de celule pe baza fenotipurilor lor, definite ca epiteliale și respectiv mezenchimale. În acest scop, nivelurile de expresie ale markerilor albumină (ALB), citokeratină-18 (KRT-18), citokeratină-19 (KRT-19), Nanog, SOX2 și vimentină (VIM) au fost evaluate în culturi de celule tumorale primare, comparativ cu țesutul tumoral original corespunzător, utilizând tehnologia qRT-PCR. Rezultatele au confirmat stabilirea a două tipuri distincte de culturi celulare primare, caracterizate printr-o morfologie epitelială susținută de prezența markerilor ALB și KRT-18 și o morfologie mezenchimală indicată de expresia markerilor KRT-19 și VIM. Toate specimenele biologice colectate și procesate de la cei 17 pacienți au fost incluse în baza de date a biobancii proiectului NEXTgenED, inclusiv organoizii derivați de la pacienți (PDO). Pentru a determina strategia de demetilare a promotorului, a fost adoptat sistemul de demetilare țintit Casilio-ME bazat pe CRISPR-Cas9. Pentru producerea și purificarea virusului adenoasociat, a fost utilizat un protocol de co-transfecție a celulelor HEK293T17 cu 3 plasmide: pAAV2/8 (codifică capsida AAV8), pAdDeltaF6 (codifică gene helper esențiale pentru producerea de AAV, de origine adenovirală), pAAV-GFP (codifică genele sistemului CRISR/Cas9). Eficiența transducției AAV care conține genele pentru editarea de bază sau editarea primară va fi evaluată utilizând un anticorp anti-dCas9 si prin vizualizarea fluorescentei produsa de expresia GFP-ului.

În final, a fost creată o bază de date integrată de probe de ADN și ARN extrase din țesuturi tumorale și non-tumorale atât pentru cohorta prospectivă NEXTgenED, cât și pentru cohorta retrospectivă propusă în etapa 2, respective 53 de pacienți (35 HCC și 18 CCA), permițând investigarea expresiei genelor specifice tumorilor hepatice și facilitând identificarea de noi biomarkeri pentru diagnostic și potențiale ținte terapeutice, în corelație cu datele clinicopatologice și moleculare ale pacienților.

ETAPA DE RAPORTARE: ETAPA 4/2025 (01.07.2025 – 31.12.2025)

Rezumat etapa 4/2025: În această etapă, au fost incluși în studiu un număr de 11 pacienți, diagnosticați cu carcinom hepatocelular (HCC) și tumori hepatice mixte (HCC + colangiocarcinom). În plus, au fost generate probe de culturi primare 2D și organoizi, provenite din țesutul tumoral și non-tumoral. În perioada de raportare, au fost incluse în biobancă: culturi primare 2D non-tumorale (n=5) și tumorale (n=5); organoizi tumorali (n=7) și non-tumorali (n=8). De asemenea, a fost optimizat protocolul de imunohistochimie a culturilor 3D, care a condus la caracterizarea acestora. În cadrul OB1: Reactivarea genelor hipermetilate patologic care sunt implicate în dezvoltarea cancerelor hepatice în modelele organoide prin editarea genomului cu ajutorul CRISPR/Cas9, a fost identificat un pacient diagnosticat cu HCC, care prezintă hipermetilarea promotorului genei CDKN2A. Datele au fost confirmate cu ajutorul liniilor celulare imortalizate Huh7-D12 (cu promoter hipermetilat) comparativ cu HepG2 (control). Astfel, pentru finalizarea acestui obiectiv, au fost generați cinci vectori plasmidiali multiplex, care conțin 2/3/4/5/6 molecule guide RNAs. În vederea îndeplinirii OB2 și OB3, au fost interpretate datele de secvențiere a întregului genom (WGS) pentru trei pacienți cu HCC (incluși în cadrul proiectului), în probe de țesut tumoral și non-tumoral adiacent, pentru a profila complet mutațiile somatice. Analiza datelor de secvențiere a identificat două mutații punctiforme cunoscute la un pacient cu HCC, ambele localizate într-o regiune hotspot. Utilizând prime editing bazată pe sistemul CRISPR/Cas9, celulele și organoizii derivați de la pacient vor fi folosiți pentru corectarea acestor mutații și pentru restabilirea secvenței de aminoacizi corespunzatoare alelei normale. Totodată, pentru a evalua nivelul de expresie al genelor cu mutații identificate, a fost realizată secvențierea întregului transcriptom la acești pacienți, iar datele au fost validate prin analiza real-time qPCR.

PUBLICATII

Articole ISI publicate:

• Immunomodulatory Functions of TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand in Type 1 diabetes – Fogarasi M, Dima S. Diabetes (Review), Cells 2024, 13(20), 1676; 2024 https://doi.org/10.3390/cells13201676
• PARP inhibitor augments anti-tumor efficacy of DNMT inhibitor by inducing senescence in cholangiocarcinoma- Peili Wang, Rong Xiao, Jianfeng Chen, Peiyong Guan, Hong Lee Heng, Lizhen Liu, Yali Wang, Xian Zeng, Guixiang Zhong, Jing Hao, Jiuping Gao, Jason Yongsheng Chan, Simona Dima, Choon Kiat Ong, Bin Tean Teh, Mei Li, Jing Han Hong, Jing Tan. Int J Biol Sci.;21(8):3649-3665, PMID: 40520005, PMCID: PMC12160928, DOI: 10.7150/ijbs.110947
• Development of vectors for reformatting scFv fragments derived from phage display libraries into native IgG1 structures for in vivo imaging and therapeutic applications – Marton Fogarasi, Corina Roman, Simona Dima. Journal of Immunological Methods, volume 542, 113899, 2025 https://doi.org/10.1016/j.jim.2025.113899

Comunicări la congrese naționale/ internaționale

1. Croitoru M-G, Ionescu V, Șorop A,  Ghionescu A-V, Toma R, Vâlcu C,  Lixandru D, Fogarasi M, Cucu D, Herlea V,  Dima S-O, Ong C-K. Metode de caracterizare a organoizilor hepatici și noi perspective pentru investigații genomice avansate. Zilele Științifice ale Institutului Clinic Fundeni. 10-12 decembrie 2025. București, România (prezentare orală).
2. Ionescu V, Croitoru M-G, Șorop A,  Ghionescu A-V, Toma R, Vâlcu C,  Lixandru D, Fogarasi M, Gheorghiu M, Herlea V,  Dima S-O, Ong C-K. Eterogeneitatea micromediului tumoral – factor determinant în optimizarea culturilor de organoizi hepatici pentru cercetare genomică. Zilele Științifice ale Institutului Clinic Fundeni. 10-12 decembrie 2025. București, România (prezentare orală).
3. Proiectul a fost promovat la International Medical Students’ Congress of Bucharest (IMSCB, https://imscbucharest.com/), un eveniment științific organizat de Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila”, desfășurat în perioada 3-7 decembrie 2025. Pentru a sprijini diseminarea, a fost pregătit și expus la congres un poster științific care a prezintat contextul, obiectivele și principalele rezultate ale proiectului. Mai mult, pe parcursul evenimentului, membrii echipei de proiect au purtat discuții științifice cu studenții și membrii facultății pe tema proiectului. Dima S-O, Fogarasi M, Lixandru D, Șorop A,  Ghionescu A-V, Croitoru M-G, Ionescu V-Ș, Roman C, Toma R-M, Petre-Lixandru I-O. In vitro models for the study of liver function assessment or therapeutic opportunities in liver cancer. International Medical Students’ Congress of Bucharest. 3-7 decembrie 2025. București, România (poster).

 

 

CONTACT: INSTITUTUL CLINIC FUNDENI

Adresa: Sos. Fundeni nr. 258, sector 2, Bucuresti

Telefon: 0213172194, Fax 021.318.04.44

E-mail: [email protected]

Director de proiect: ONG CHOON KIAT

 

 

NEXTgenED

PROJECT TITLE: ”Reactivation of hypermethylated genes and correction of pathogenic mutations by genome-editing technologies in personalized medicine approaches in HCC organoids models”

CF 150/31.07.2023, Contract no: 260281/26.03.2024

Beneficiar: Fundeni Clinical Institute

Center of Excellence in Translational Medicine (CEMT)

Total Budget without VAT: 5.999.957 lei

Project duration: 26.03.2024 – 30.06.2026

Project Leader: ONG CHOON KIAT

 

GENERAL OBJECTIVES

In the NEXTgenED project we will investigate the genetic and epigenetic causes involved in the progression of hepatocellular carcinoma (HCC). We will use the latest genome editing technologies to study the mechanism of HCC initiation and development. It has been shown that gene promoter hypermethylation plays a crucial role in the development of liver cancer. Thus, we aim to study the methylation status of promoters involved in epigenetic silencing. Specifically, we will study the demethylation of hypermethylated promoters involved in HCC by using the latest Casilio (CRISPR/Cas9 system) and primary genome editing technologies to achieve gene promoter demethylation and restore gene expression along with the corresponding protein. We will also investigate the role of mutations in liver cancer development. We intend to use base editing and primary editing technologies to correct mutations and restore the amino acids of the normal allele. We aim to perform this genetic investigation using both primary cell cultures and organoid cultures to perform a comprehensive study that will lead us to a better understanding of HCC initiation and development. We will also perform a comparative study between non-tumor organoids, tumor organoids, and mutation-corrected tumor organoids along with drug screening.

The implementation of the project will elucidate the roles of genetic and epigenetic defects that arise during HCC initiation and development and will develop new therapeutic strategies.

Specific Objectives

 

SO1: Reactivation of pathologically hypermethylated genes that are involved in the development of liver cancers in organoid models by genome editing using CRISPR/Cas9

SO2: Correction of pathogenic indel (insertion and deletion) mutations by primary editing

SO3: Reintroduction of amino acid from normal allele into mutant gene using primary editing and base editing technologies

SO4: Comparative study for clinical translation of organoids derived from drug-treated patients (with uncorrected and corrected mutations) and drug screening to identify sensitivity to therapeutic agents of organoids

 

Generation of organoids from patient tissue with HCC allows testing of a range of therapeutic agents with applications in personalized medicine.

 

All these objectives will allow us to gain a mechanistic insight into the processes of HCC initiation and evolution in organoids, which may lead to personalized treatment of HCC patients.

 

RESULTS

REPORTING STAGE no.1/2024 (01.04.2024 – 30.06.2024)

Summary stage no. 1/2024: The approval for the implementation of the study was obtained, no. 32744/08.07.2024 by the Ethics Committee of the Fundeni Clinical Institute. The inclusion of patients in the NEXTGenED project will be done in compliance with the national and international ethical norms in force according to the freely expressed consent. The procedure for receiving and processing samples (Biobanking) will include specific procedures for tissue and blood banking. For all samples received for registration and biobanking, a biological sample reception form (study inclusion form) was established. During the reporting period, work protocols and procedures were developed, thus the work protocols were drawn up for 1) isolation of liver cells 2) dissociation of liver cells and 3) Seeding of cells in matrigel to obtain organoids 4) passage of organoids and 5) in vitro differentiation of hepatocytes. Development of protocols and standard operating procedures for Stage 2 activities was initiated, focusing on the construction of sgRNAs targeting the demethylation of the CDKN2A promoter, as well as the production and purification of adeno-associated viruses (AAVs), and lentiviruses. The following steps were carried out: (1) primer design, (2) optimization of the protocol for AAV production and purification, and (3) optimization of the protocol for lentiviral production and purification.

REPORTING STAGE no.2/2024 (01.07.2024 – 31.12.2024)

Summary stage no. 2/2024 During stage 2, the activity of including patients in the study was initiated, respectively isolating primary liver cells with sample banking for 19 patients, while the master cell bank (P0-P4) was created for 9 donors in order to carry out the proposed experiments. At the same time, the amplification of the plasmids necessary for demethylation of the CDKN2A promoter was carried out. For this purpose, competent DH5 α cells were prepared and transformed with the constructs necessary for demethylation, and then the plasmid DNA was isolated. The process of cloning sgRNAs specific for the CDKN2A promoter was initiated. Before actually cloning the sgRNA, it is necessary to construct 2 vectors: one being represented by the cloning vector, and the other vector that will serve as a template for generating the 8 sgRNAs. Thus, for the generation of the 2 constructs, the vector and two fragments were amplified followed by Gibson assembly. In order to determine the methylation status of the CDKN2A promoter, genomic DNA was isolated from HepG2 and Huh7 cell lines using a kit, followed by bisulfite treatment to convert unmethylated cytosine to uracil, thus determining the methylation status of the promoter. Total RNA was also isolated from HepG2, Huh7 and Hep3B cell lines in order to clone the TP53, CTNNB1, LRP1B, ARID1A, AXIN1, ARID2 genes and determine the presence of point mutations and indel mutations. In this context, the plasmids necessary for the correction of point and indel mutations were amplified and isolated, and then the identity of the isolated plasmids was verified by digestion with restriction enzymes with unique cleavage specificity in the plasmid sequence.

REPORTING STAGE no.3/2025 (01.01.2025 – 30.06.2025)

Summary stage no. 3/2025 During phase 3, the activity of including patients in the study continued, respectively isolating liver primary cells, with sample banking being carried out for 17 patients while the master cell bank for patients derived organoids (PDO) (P0-P4) was created for 6 normal and 4 tumoral  in order to carry out the proposed experiments. The patients were classified according to their conditions as follows: 9 patients with hepatocellular carcinoma (HCC), 2 patients with metastatic adenocarcinoma (ADK), 1 patient with cholangiocarcinoma and 5 patients are undergoing pathological diagnosis. The group is represented by 65% men and 35% women, with an average age of 65 years. At the same time, two distinct cell types were identified based on their phenotypes, defined as epithelial and mesenchymal, respectively. For this purpose, the expression levels of the markers albumin (ALB), cytokeratin-18 (KRT-18), cytokeratin-19 (KRT-19), Nanog, SOX2 and vimentin (VIM) were assessed in primary tumor cell cultures compared to the corresponding original tumor tissue using qRT-PCR technology. The results confirmed the establishment of two distinct types of primary cell cultures, characterized by an epithelial morphology supported by the presence of ALB and KRT-18 markers and a mesenchymal morphology indicated by the expression of KRT-19 and VIM markers. All biospecimens collected and processed from the 17 patients were included in the NEXTgenED project biobank database, patients derived organoids (PDO) included.

In order todemethylate the CDKN2A promoter, the Casilio-ME targeted demethylation system based on CRISPR-Cas9 was adopted. Cloning the eight sgRNAs of interest required the construction of two intermediate vectors: a cloning vector and a template vector containing the sequence required for their amplification. For the production and purification of adeno-associated virus, a protocol of co-transfection of HEK293T17 cells with 3 plasmids was used: pAAV2/8 (encodes the AAV8 capsid), pAdDeltaF6 (encodes essential helper genes for AAV production, of adenoviral origin), pAAV-GFP (encodes the system CRISPR/Cas9). The transduction efficiency of AAV containing the genes for base editing or primary editing will be assessed using an anti-dCas9 antibody.

Finally, an integrated database of DNA and RNA samples extracted from tumor and non-tumor tissues was created for both the prospective NEXTgenED cohort and the retrospective cohort proposed in the previous stage (53 patients, 35 HCC and 18 CCA), allowing the investigation of gene expression specific to liver tumors and facilitating the identification of new biomarkers for diagnosis and potential therapeutic targets, in correlation with the clinicopathological and molecular data of the patients.

REPORTING STAGE no.4/2025 (01.07.2025 – 31.12.2025)

Summary stage no. 4/2025: During this stage, eleven patients diagnosed with hepatocellular carcinoma (HCC) and mixed primary liver tumors (HCC combined with cholangiocarcinoma) were enrolled in the study. Primary two-dimensional (2D) cultures and three-dimensional (3D) organoid models were successfully established from both tumoral and matched non-tumoral liver tissues.

During the reporting period, the biobank was expanded to include non-tumoral (n = 5) and tumoral primary 2D cultures (n = 5), as well as tumoral (n = 7) and non-tumoral organoids (n = 8). In parallel, the immunohistochemistry protocol for 3D cultures was optimized, enabling detailed phenotypic and molecular characterization of the organoid models.

A patient with HCC exhibiting CDKN2A promoter hypermethylation was identified, as part of activities performed for objective OB1: Reactivation of pathologically hypermethylated genes implicated in hepatocarcinogenesis in organoid models through CRISPR/Cas9-mediated genome editing. These epigenetic alterations were further validated using immortalized hepatic cancer cell lines, with Huh7-D12 being found to be hypermethylated at the CDKN2A promoter compared to HepG2 (non-hypermethylated control). To support the completion of this objective, five multiplex CRISPR/Cas9 plasmid vectors were generated, each incorporating 2, 3, 4, 5, or 6 guide RNA (gRNA) sequences.

For OB2 and OB3, whole-genome sequencing (WGS) data from paired tumoral and adjacent non-tumoral tissue samples of three HCC patients included in the project were analyzed, allowing comprehensive identification and profiling of somatic mutations. Analysis of the sequencing data identified two known missense point mutations in a patient with HCC, both localized within a hotspot region. Using CRISPR/Cas9-based prime editing, patient-derived cells and organoids will be employed to correct these mutations and restore the wild-type amino acid sequence. Furthermore, whole-transcriptome sequencing was performed to quantify the expression levels of genes harboring the identified mutations. Transcriptomic findings were subsequently validated by real-time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis, ensuring the robustness and reliability of the results.

PUBLICATIONS

Articole ISI publicate:

• Immunomodulatory Functions of TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand in Type 1 diabetes – Fogarasi M, Dima S. Diabetes (Review), Cells 2024, 13(20), 1676; 2024 https://doi.org/10.3390/cells13201676
• PARP inhibitor augments anti-tumor efficacy of DNMT inhibitor by inducing senescence in cholangiocarcinoma- Peili Wang, Rong Xiao, Jianfeng Chen, Peiyong Guan, Hong Lee Heng, Lizhen Liu, Yali Wang, Xian Zeng, Guixiang Zhong, Jing Hao, Jiuping Gao, Jason Yongsheng Chan, Simona Dima, Choon Kiat Ong, Bin Tean Teh, Mei Li, Jing Han Hong, Jing Tan. Int J Biol Sci.;21(8):3649-3665, PMID: 40520005, PMCID: PMC12160928, DOI: 10.7150/ijbs.110947
• Development of vectors for reformatting scFv fragments derived from phage display libraries into native IgG1 structures for in vivo imaging and therapeutic applications – Marton Fogarasi, Corina Roman, Simona Dima. Journal of Immunological Methods, volume 542, 113899, 2025 https://doi.org/10.1016/j.jim.2025.113899

Presentations at National and International Conferences

1. Croitoru M-G, Ionescu V, Șorop A,  Ghionescu A-V, Toma R, Vâlcu C,  Lixandru D, Fogarasi M, Cucu D, Herlea V,  Dima S-O, Ong C-K. Methods for liver organoids characterisation and new perspectives for advanced genomic investigations. Fundeni Clinical Institute Scientific Days. 10-12 December 2025. Bucharest, Romania (oral presentation).
2. Ionescu V, Croitoru M-G, Șorop A,  Ghionescu A-V, Toma R, Vâlcu C,  Lixandru D, Fogarasi M, Gheorghiu M, Herlea V,  Dima S-O, Ong C-K. Heterogeneity of the tumor microenvironment – ​​a determining factor in optimizing liver organoid cultures for genomic research. Fundeni Clinical Institute Scientific Days. 10-12 December 2025. Bucharest, Romania (oral presentation).
3. The project was promoted at the International Medical Students’ Congress of Bucharest (IMSCB, https://imscbucharest.com/), a scientific event organized by the “Carol Davila” University of Medicine and Pharmacy, held between 3-7 December 2025. To support dissemination, a scientific poster outlining the project background, objectives, and main results was prepared and displayed at the congress. This dissemination effort increased the project’s visibility within the academic and student research communities. Moreover, throughout the event, members of the project team engaged in scientific discussions with students and faculty members regarding the project. Dima S-O, Fogarasi M, Lixandru D, Șorop A,  Ghionescu A-V, Croitoru M-G, Ionescu V-Ș, Roman C, Toma R-M, Petre-Lixandru I-O. In vitro models for the study of liver function assessment or therapeutic opportunities in liver cancer. International Medical Students’ Congress of Bucharest. 3-7 December 2025. Bucharest, Romania (poster).

 

CONTACT

Beneficiary: Fundeni Clinical Institute

Center of Excellence in Translational Medicine (CEMT)

Address: 258, Sos. Fundeni, sector 2, Bucharest

Telephone: 0213172194

Fax: 021.318.04.44

E-mail: [email protected]

Project Leader: ONG CHOON KIAT